犹如大力水手爱吃菠菜，这款CAR-T要“吃”四环素才工作——

    CAR-T是一种出现了很多年，但近几年才得以临床应用的新型细胞疗法。日前，《分子科学》登载了我国科学家对于CAR-T安全性的研究工作：上海海洋大学国际海洋生物科学研究中心、比昂生物等多个单位合作，运用我国拥有自主专利的慢病毒载体技术，将“四环素调控”的基因开关整合到时下最广泛使用的白血病治疗手段CAR-T中，实现了对CAR-T细胞的控制，只有当CAR-T感受到四环素这一特定化合物的存在时，才会启动“格斗”模式，勤恳杀敌，而一旦有指标表明T细胞有“杀红眼”的迹象，只需停止四环素的供应，CAR-T格斗士就会缺乏能量宕机，防止对机体的“自杀式”损伤。

    T细胞“火力全开”，伴随可怕“风暴”

    免疫疗法的出现，使得人体内免疫系统被“争取”过来，通过对T细胞加装体外基因元器件或重启免疫杀伐功能，形成对抗肿瘤的“生力军”。目前，治疗白血病有效率最高的方法为CAR-T疗法，是通过将T细胞导出，在体外装上有“导航”“侦测”作用的CAR（嵌合抗原受体），再回输体内对付癌细胞，但T细胞的进攻“火力”会由于人工的干预，而不受体内调控机制的控制，“失控”的情况下很可能造成严重的细胞因子释放综合征（CRS）。

    “CRS被业界形象地称为‘细胞因子风暴’。”论文通讯作者、上海海洋大学特聘教授杨光华解释，细胞因子风暴是由T细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞之间的相互作用引起的。由于“重装战士”T细胞有导航和侦测系统，它能够敏锐地感受到肿瘤细胞的存在，细胞内通路进而被激发，释放大量的细胞因子，这些细胞因子正是免疫细胞杀伐肿瘤细胞、能够使其凋亡的“重要火力”。

    “细胞因子引发的风暴是CAR-T治疗中不可回避的。”杨光华说，它不但是治疗中的副作用，也是治疗肿瘤的临床表现。

    美国女孩艾米丽（Emily）是首位CAR-T治愈的白血病患儿，她有着可怕的“风暴”经历。据记载，在细胞注射到体内后，艾米丽迅速发烧，血压骤降，重度昏迷，在重症监护室里靠呼吸机熬过了两周。当时医生们已经觉得她不可能活下来了。检测报告显示，她体内的IL-6蛋白激增，这表明她的免疫系统正在不断攻击自身。随后，医生决定给她使用一种免疫抑制药物阻止这种自身攻击。用药后几小时内，艾米丽的情况立即变好，进一步检测结果显示，她体内的癌细胞消失了。

    可见，CAR-T诱发“风暴”不可避免。但由于CAR-T拥有80%—90%的高治愈率，使得尽管这种疗法相当危险，去年仍被美国食品和药物管理局（FDA）批准可用于临床，并于今年4月被批准进入美国医保。

    如何让拥有高治愈率的CAR-T告别高风险？学界进行了大量的研究，并提出多种技术路线，例如施用免疫抑制药物、植入诱导型自杀基因系统、严重情况需采用激素处理等，但目前“风暴”并发症仍是其成为标准医疗护理的障碍。业内普遍认为，CAR-T应用的难点并不集中在前期的细胞治疗，而在于后期的副作用处理及质量控制。

    “抑制剂的‘补救’很难掌握主动权。”杨光华表示，通过基因元件的“供能”控制将更具有主动权，也有更多地可操作性。

    变病毒为友军，给T细胞加个“遥控器”

    “CAR-T技术专利几乎被美国涵盖。”杨光华说。实际上，美国医疗领域仍在不断探索新机制，例如今年4月《自然》报道，纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSK）发现预防“风暴”的新细胞理论以及新抑制剂并已经申请专利。

    “我们不能跟着别人的思路对‘风暴’进行控制，那到应用时会遇到‘专利门槛’。”杨光华说，为此，他带领团队从2009年开始从另一个角度入手，试图给T细胞加个“遥控器”，增加CAR-T技术中人们对T细胞的控制力。

    “慢病毒载体是人们进行基因工程操作的一个有效工具。”杨光华说，慢病毒载体和病毒一样能够“侵入”细胞，但并不具有毒性，能把目标片段插入目标细胞中，从而实现基因的改造。

    要把病毒“驯化”成友军并不容易，临床要求严格，并且大规模生产和纯化非常困难。杨光华团队试图通过慢病毒载体对CAR-T进行改良，并使其实现工业化生产，同时依托该技术成立了上海比昂生物医药科技有限公司。“不同于常见的化学合成药物，基因药物的大规模生产与纯化非常困难。目前在基因载体大规模生产上，比昂生物的纯化率已经比国际同行的高10倍。”杨光华说，慢病毒载体的生产包含了质粒获取、细胞转染、病毒收集与纯化等一系列复杂的步骤，每一个步骤都会影响最后获得的载体活性，因此需要在工艺上不断优化，才能得到高质量的载体。

    在转导过程中，团队对载体用量、转导条件、T细胞培养、增强剂的使用等关键条件进行了探索与优化，最后取得成功。“所有的技术都已申请了专利。核心发明专利已经由国际专利体系PCT授权。”杨光华说，“我们同时具有病毒类载体大规模生产工艺专利技术，可满足国内外制药公司、医院等对CAR-T可诱导慢病毒的需要，用于Ⅰ期和Ⅱ期的临床实验。”

    体外实验证明，“四环素调控系统”高效

    “开关系统通过基因合成、酶切连接等分子生物学技术，我们将‘四环素调控系统’与CD19-CAR结构一起整合进慢病毒载体中。”杨光华说，这样在对T细胞进行CAR改造的同时，“四环素遥控器”也就同步装配了。

    服用四环素后，进入人体的CAR-T就开始发挥作用；停止服药后，CAR-T将不再表达，而且能通过药物剂量来控制CAR-T疗效的强弱。这样带来的好处是当患者出现难以承受的不良反应时，停止服用四环素就可以让患者体内发挥作用的CAR-T停下来，当患者耐受性逐渐转好之后，又可以通过服药继续开始治疗。在间隔期间，B细胞可以恢复，增强抗癌效果。

    “临床前的基本研究，取得了效果非常好的数据。”杨光华说，在此次研究中，他们通过将“四环素调控系统”结合到CD19-CAR构建物中，开发出新的诱导性细胞iCAR19 T。

    试验数据表明，新的iCAR19 T细胞增殖、细胞因子产生、CAR表达、CD19特异性细胞毒性强。用四环素衍生物诱导48小时后，诱导细胞的相对CAR表达量是未诱导细胞的5倍，说明四环素的施用能激发“四环素战士”的战斗力。此外，经四环素衍生物处理的细胞对靶细胞有非常显著的高特异性裂解。这些结果表明植入系统成功地控制了iCAR19 T细胞的活性。“我们对T细胞的控制力越强，临床安全性将越强。”杨光华说，新的细胞同时保持了强大的抗肿瘤作用。

    “这项技术在实际应用于人体之前还需要经过动物实验、临床试验等多个步骤验证其安全性和有效性。我们正在针对实际使用过程中可能遇到的问题，对这一技术做进一步优化调整，以尽快开展体内的实验验证。”杨光华说，团队的目标是临床应用，因此在实验阶段就遵循GMP生产标准，所有的制造工艺和随后的检测都在GMP设施中进行，基因载体的质量控制也严格遵循FDA的指导原则。