解码基因编辑

    演艺界宋仲基宋慧乔的分手让人直呼：只愿曾经未相遇。而生物界的相遇却往往让人感慨：相见恨晚——

    张锋，一位“八零后”科学家，因发明最有效的基因编辑方法成名，被称为CRISPR之父。

    芭芭拉·麦克林托克，很多人并不熟悉，但她所在的冷泉港实验室被认为是思想最活跃的科研圣地。芭芭拉是上个世纪的“零零后”（1902年出生），在她的年代，人们认为基因是“牢固锚定”的，但她却要证明基因是能够“跳动”的，她的系统性研究和对科学的坚持，最终打破了人们保守的观念，并因此获得1983年的诺贝尔奖。

    两位科学家跨越百年的研究成果终于“相遇”。《科学》和《自然》近日接连发文介绍了两种新型CRISPR技术，均是通过利用“跳跃基因”的性质改进CRISPR技术的靶向准确性。

    都能编辑基因，“单身”时它们这样工作

    CRISPR/Cas9技术是CRISPR技术的全称，前面的“CRISPR”是“制导靶标”，后面的Cas9才是真正的“剪刀”。

    在基因的世界里，“制导”一定是依赖碱基序列的，对于CRISPR来说，它只认定一种序列那就是成簇、规律间隔、短回文、重复序列。通过向导RNA识别符合要求的序列，引来Cas9蛋白对序列进行切割。

    切割过程有着“抖音小视频”的动态特点。Cas9蛋白先与向导RNA形成复合体，Cas9蛋白会发生构象上的变化，就像一张白纸卷成一个“筒状”，更容易让DNA进出。这个柔软的复合体会在DNA里四处碰撞，如果识别错误，“红灯亮”，复合体就离开，继续下一次碰撞；如果识别正确，“绿灯亮”，开始剪切编辑的尝试。

    Cas9蛋白开始“动剪刀”前，还需要再校验，它把双链DNA解旋，利用RNA-DNA碱基互补配对原则，进一步核对序列与RNA的互补情况。如果出现较多错配，则序列识别过程终止，从而确保Cas9在正确的目标处发挥作用。如果完成识别，那么Cas9进一步被激活，开动剪刀。

    跳跃基因则完全不同，它不受约束，“痛恨”一切教条，与CRISPR“重复”“短回文”等教条的属性似乎完全不在一个“频道”。它可以从自己的位置上“自由出走”，单独复制或断裂下来，并为自己“编制”一个环状船，四处“游走”，遇到合适的地方，再插入另一位点。

    芭芭拉发现它是因为它所引发的玉米形状的随意变化。她在印度彩色玉米中观察到，籽粒和叶片往往存在着许多色斑。色斑的大小、出现的早晚不定，这些变化，受到某些不稳定基因或“异变基因”之间相互调控的控制。

    跳跃基因堪称“自由主义者”的典范，人们至今难以把握什么能激活它的跳跃。但大名鼎鼎的LINE1是一种主要的跳跃基因，《细胞》子刊刊载科学家“抓住了它的尾巴”，只有在POLY-A（多聚A）“尾巴”存在的情况下，LINE1才会启动跳跃，没有“尾巴”跳跃基因就会失活。此外，转座酶是启动转座的关键性因子，目前，人们已经掌握了通过转座酶引导和控制跳跃基因的一些方法。

    一对天然“CP”，双方何以“互补”

    CRISPR/Cas9基因编辑技术，现阶段面临着精确修复比例低、识别序列受限、脱靶现象等问题。根据基因“魔剪”的工作机理，可以看出单独的“制导定位”、解链剪切、互补修复理论上都是行得通的。

    问题出在外来的干预和影响，势必会遭受系统本身的校正。“只要向导RNA设计得当、定位准确，精准删除相应的DNA片段并不难。”相关专家表示，但在替换过程中，会激活体内的DNA修复系统，这套修复系统有着较高的容错能力，有可能变成可以耐受DNA损伤的问题基因。

    而CRISPR携带的目标基因需要靠同源重组才能结合到靶基因组中，同源重组容错率低，遵循配对原则，因此面临着修复系统“竞争”，导致整合效率低下，甚至完全被压制，造成难以想象的脱靶效应。

    向对于CRISPR依赖的同源重组进行序列插入，转座子的“移花接木”功能更加强势。细菌中的Tn转座子，是一段含有若干抗性基因和编码转座酶基因的DNA片段。两末端重复或倒置，对应转座酶的作用位点。当结合到靶DNA上时，转座复合体识别并攻击靶序列将转座子插入到靶序列中。整个转座过程完成了基因从原始DNA被剪切之后粘贴在另一受体DNA的过程，实现了基因的“跳跃”。

    新的研究工作，正是将关键的Cas9“剪刀”进行了改变，取而代之一种新的复合酶。据介绍，研究人员建立了一种CRISPR相关转座酶，一半是CRISPR效应蛋白Cas12k，与Cas9一脉相承，但对DNA只结合不剪切，只负责定位靶基因组，剪切替换的工作由转座酶“接手”，可以将基因片段直接插入靶位点，完全免除了对靶基因组的切割步骤。

    可见，跨越百年的相遇，体现在对于关键酶的改良中，通过对不同来源的酶的整合、改造，使得新的Cas系统产生。据测试结果显示，该系统能在大肠杆菌（原核生物）基因组中实现高达80%的插入成功率，而远远高于CRISPR/Cas9系统相应编辑的成功率。

    事实上，这并不是首次尝试将两种编辑基因的方法联合起来。据报道，《BMC生物学》杂志2014年发表了一项研究，科学家们在细菌和古生菌中发现了一类新型的转座子，这种转座子不仅含有Cas内切酶的编码基因，还依赖这种酶整合到新的基因组区域，科学家将这种新型的转座子元件称为“Casposon”。可见，这对“CP”可能原本就存在于自然界中。

    编辑不同物种，改良一直在路上

    基因编辑CRISPR/Cas9系统是源自于原核生物抵御外来遗传元件的侵袭进而开发出来的。Tn7转座子也来源于原核生物大肠杆菌。前者把握了方向，后者进行了实际操作。

    在真核基因中，它们表现如何，仍需要进一步地反复尝试、修改和验证。

    “马赛克现象”是该基因编辑工具应用于真核生物生殖细胞编辑时一直难以解决的问题。“我们用显微注射的方法对受精卵进行CRISPR基因编辑，希望获得相应的基因编辑动物。”武汉大学中南医院研究助理教授姬燕晓表示，但这些方式获得的动物个体可能同时带有编辑细胞与未编辑细胞的嵌合个体。也就是说有的基因编辑小鼠可能只有腿部细胞编辑成功，或者其他局部，这对于构建动物模型来说是非常影响效率的。

    “我们只能从转基因动物下一代中筛选确定能够稳定遗传的个体，这对于大动物来说，非常耗时耗力。”姬燕晓说。

    广东医科大学袁伟曦等在《CRISPR/Cas9技术存在的问题及其改进措施的研究进展》中分析，“马赛克现象”的发生，可能是由于CRISPR/Cas9系统应用于多细胞生物的受精卵基因编辑时，受精卵分裂成不同的卵裂球，而Cas9蛋白对不同卵裂球的编辑能力和修复方式不同，从而出现带有不同编辑类型的细胞的嵌合个体；也可能是受精成功到基因组第一次复制的时间极为有限，给基因编辑留下的“时间窗”很短。

    为此，对于基因编辑技术提高精准性、降低错配率等的研究工作仍需要持续推进，以针对不同的物种，获得最优的组合和解决方案。